小文章來自中原酒報; 　β—葡萄糖苷酶又稱β—D—葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它可以水解糖鏈末端非還原性的β—D—葡萄糖苷鍵。β—葡萄糖苷酶是纖維素酶的主要組成成分，直接影響著纖維素酶的降解能力。

　　此外，β—葡萄糖苷酶在食品行業中也有著廣泛的應用，如作為水果和茶葉的風味酶，水解大豆異黃酮甙元等。β—葡萄糖苷酶存在于自然界很多植物中，也存在于酵母、曲霉屬、木霉屬及一些細菌中。黑曲霉是公認安全的微生物之一, 在纖維物質的誘導下，黑曲霉可產生胞外β—葡萄糖苷酶。

　　筆者研究了黑曲霉固態發酵啤酒糟產β—葡萄糖苷酶的工藝條件，同時探討了β—葡萄糖苷酶合成的動力學機制，望能為啤酒糟的再利用提供一定數據依據。

    　1 材料和方法
    　1.1 菌種
    　黑曲霉購于廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心。
    　1.2 試劑和設備
    　1.2.1 主要試劑
    　啤酒糟由蚌埠學院生物與食品工程系啤酒發酵實驗室提供；
    　水楊苷（進口分裝）、微晶纖維素（進口分裝）、羧甲基纖維素鈉（CMC）、 3， 5—二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚。
    　1.2.2 主要設備
    　752分光光度儀（上海菁華科技儀器有限公司）、DH Z—D冷凍恒溫振蕩器（江蘇太倉市實驗設備廠）、SFAT—8000固態發酵罐（常州新區三環生物工程成套設備有限公司）。

    　1.3 培養基
    　斜面培養基：PDA培養基；
    　發酵培養基：啤酒糟5g置于500ml 三角瓶中，用基本培養液調初始含水量，121℃滅菌20min。

    　1.4 試驗方法
    　1.4.1 粗酶液的制備
    　黑曲霉在無菌條件下接入斜面培養基，30℃培養72h。每100ml  無菌水接入1環孢子配置種子懸浮液( 1.15×106 /ml )。按一定料液比將種子懸浮液接入滅菌后的發酵培養基中，培養96h。用100ml去離子水浸提培養基，攪拌1h，抽濾，在3000r/min條件下離心15min，收集上清液，即為粗酶液。
    　1.4.2 單因素分析
    　在其他條件不變的情況下，分別測定不同溫度、料液比和接種量對β—葡萄糖苷酶酶活的影響。
    　1.4.3 正交分析
    　利用L9( 34 )正交試驗優化β—葡萄糖苷酶的發酵條件。
    　1.4.4 動力學研究
    　發酵過程中，每隔24h分別測定發酵培養基中Cx 酶、β—葡萄糖苷酶和C1酶的活性，分析β—葡萄糖苷酶酶活隨時間的變化情況。

    　1.5 酶活力的測定
    　1.5.1 β—葡萄糖苷酶活力的測定。取4支洗凈烘干的10ml具塞刻度試管， 編號后各加入1.5ml0.5%水楊酸苷檸檬酸緩沖液，向1號試管中加入1.5mlDNS溶液以鈍化酶活性，作為空白對照，比色時調零用。將4支試管同時在50℃水浴中預熱5min—10min，再各加入酶液0.5ml，50℃水浴中保溫30min，取出后立即分別向2、3 和4號試管中加入1.5ml DNS 溶液以終止酶反應，充分搖勻后沸水浴5min，取出冷卻后用蒸餾水定容至10ml，充分混勻。
    　以1號試管溶液為空白對照調零點，測定2、3和4號試管液的吸光度值并記錄結果。定義在測定條件下，1min內水解水楊酸苷生成1μmol葡萄糖所需的酶量為一個酶活單位（U）。

    　1.5.2 葡萄糖內切酶（CX）活力的測定 以羧甲基纖維素鈉為底物，方法同上。
    　1.5.3 葡萄糖外切酶（C1）活力的測定 以微晶纖維素為底物，方法同上。
    　1.5.4 還原糖的測定 采用DNS（3，5—二硝基水楊酸）法。

    　2 結果與分析

    　2.1單因素分析
    　溫度是黑曲霉生長的重要條件之一，它不僅影響著菌體的生長速率，同時也制約著代謝產物的水平。在30℃條件下，β—葡萄糖苷酶的活力最高，而40℃時酶活最低。值得注意的是，從培養基孢子生長情況上看，25℃條件下，黑曲霉產生的孢子稀疏，主要以菌絲體為主；而在37℃條件下，孢子生長的十分密集，但兩者β—葡萄糖苷酶的酶活相差不是很大。

    　這一現象表明，兩種產酶機制的不同，25℃更適合β—葡萄糖苷酶的生成，而37℃時，雖然產酶水平不高，但孢子數量巨大，產生的總酶活也高。
    　在固態發酵中，初始含水量主要影響著菌體對氧氣的攝取。按料液比（培養基：水，g/ml）1：5配置培養基的初始含水量時酶活最高。當含水量過高時，由于限制了培養基對氧的攝取，產酶水平開始下降。

    　在一定范圍內，隨著接種量的增大，酶活逐漸變大，當接種量增大到10%以上后，酶活變化減小，這可能是由于菌種數量過大，導致培養基營養成分的迅速消耗，從而影響酶的產量（見表2）。

    　2.2正交試驗優化發酵工藝
    　利用正交表設計L9（ 34 ）正交試驗, 溫度的三個水平分別為25℃、30℃和37℃；含水量分別為1：1、1：3 和1：5；接種量為2%、5%和10%（見表1）。

    　可以看出, 在25℃、含水量1：5和接種量10%的條件下, 酶活達到10.85U / g；其中含水量對β—葡萄糖苷酶酶活具有顯著的線型相關（ p< 0.05）。

　　2.3 葡萄糖苷酶的合成特性
    　葡萄糖苷酶是纖維素酶的重要組成成分，在很大程度上決定著纖維素酶的活性。以啤酒糟為培養基，在30℃，接種量10%和料液比1：5的條件下，利用固態發酵罐進行發酵，每隔24h測定黑曲霉產β—葡萄糖苷酶， 繪制各種酶的酶活變化曲線。

    　Cx酶在72h時達到產酶的高峰期，而β—葡萄糖苷酶的酶活則繼續增大。在96h后，β—葡萄糖苷酶酶活的增幅變小，這一現象可能說明，在96h時該酶已經進入產酶的高峰期；此后，由于菌絲體發生自溶，胞內的β—葡萄糖苷酶釋放到培養基中，使酶活進一步變大。利用啤酒糟作為培養基，β— 葡萄糖苷酶的酶活要遠高于Cx酶，而用其它培養基時，Cx酶的酶活要高于β—葡萄糖苷酶，這表明啤酒糟適合于β—葡萄糖苷酶的發酵生產。

    　3 結論

    　目前，β—葡萄糖苷酶主要是利用微生物發酵進行生產，尤其是黑曲霉和米曲霉，培養基多為麩皮、蛋白胨和各種無機鹽。

　　有研究表明，初始pH值對于β—葡萄糖苷酶的產量有著重要的影響。

    　啤酒糟富含各種營養成分，有利于誘導β—葡萄糖苷酶的產生，可能成為該酶發酵生產的天然培養基。實驗表明，在25℃，料液比1：5和接種量10%的固態發酵條件下，酶活可達到10.85U / g；動力學研究顯示，β—葡萄糖苷酶在96h進入產酶高峰期，120h時達到酶活最高值。此外，發酵后的啤酒糟由于纖維結構被破壞，從而更容易被動物吸收，可能成為較好的有機飼料。