本文(wen)借鑒了一(yi)些植物多糖中單糖組分的分析方法，采用氣(qi)相色譜法直(zhi)接(jie)測定(ding)葡萄糖含(han)量(liang)，具有分析速度快(kuai)、選擇性強、靈(ling)敏(min)度高和測定(ding)結果精確(que)可靠等優點，從而為啤酒酵母(mu)中β—葡聚糖含(han)量(liang)的測定(ding)提供(gong)新參考。

    　1  材料與(yu)方法

    　1.1 材料(liao)與(yu)試劑

    　啤酒酵(jiao)母廣州市珠江(jiang)啤酒廠(chang)；β—葡聚糖日(ri)本ADEKA株(zhu)式會社；風味蛋白酶(mei)、Alcalase2.4L 諾維(wei)信公司；丙酮(tong)、三氟乙酸、鹽酸羥胺、吡啶、乙酸酐等天津市化(hua)學試劑一廠(chang)，分(fen)析純(chun)；標準葡萄糖、甘露糖 上海源聚生物科技有限(xian)公司，分(fen)析純(chun)。

    　1.2 .1儀器與(yu)設備

    　本(ben)實驗(yan)采用(yong)乙(yi)酰化(hua)(hua)作為衍(yan)(yan)生化(hua)(hua)方法，其反(fan)應(ying)(ying)原理是：標準(zhun)單(dan)糖和鹽酸羥(qian)胺在溶劑(ji)吡啶中加熱(re)反(fan)應(ying)(ying)生成糖肟，以乙(yi)酸酐作為乙(yi)酰化(hua)(hua)試(shi)劑(ji)，在加熱(re)條件下繼續反(fan)應(ying)(ying)，最(zui)后生成具有揮(hui)發(fa)性的糖腈乙(yi)酸酯衍(yan)(yan)生物。

    　GC—2014 氣相色譜(pu)儀(yi)(yi)配(pei)備(bei)氫火焰離(li)子(zi)化檢測器FID ，日(ri)本島津(jin)公(gong)(gong)司(si)(si)(si)；KQ—250DE 型(xing)數控超聲(sheng)清洗器，昆山市(shi)超聲(sheng)儀(yi)(yi)儀(yi)(yi)器有(you)限(xian)公(gong)(gong)司(si)(si)(si)；雷磁PHS—3C 精密(mi)pH 計，上海精科儀(yi)(yi)器有(you)限(xian)公(gong)(gong)司(si)(si)(si)；N—EVAP111型(xing)氮吹儀(yi)(yi)，美國Organomation公(gong)(gong)司(si)(si)(si)；5804R型(xing)高速冷凍離(li)心機，德(de)國Eppendorf 公(gong)(gong)司(si)(si)(si)；RE—52型(xing)旋轉蒸發儀(yi)(yi)，上海亞榮生化儀(yi)(yi)器廠；SHZ—D(III) 型(xing)循環水式(shi)真(zhen)空(kong)泵，鞏(gong)義市(shi)予華儀(yi)(yi)器有(you)限(xian)責任公(gong)(gong)司(si)(si)(si)；HHS型(xing)電(dian)熱恒溫(wen)水浴鍋(guo)，上海博迅實業有(you)限(xian)公(gong)(gong)司(si)(si)(si)醫療設備(bei)廠。

    　1.2 .2β—葡聚糖的制備(bei)

    　工(gong)藝流(liu)程：新鮮啤(pi)酒(jiu)酵母→200目(mu)過(guo)篩除去啤(pi)酒(jiu)花等雜(za)質(zhi)→水洗(xi)除去剩余啤(pi)酒(jiu)→離(li)心分(fen)離(li)→將沉淀溶(rong)于水配成反(fan)應體系進行自(zi)溶(rong)→加(jia)鹽(yan)破壁(bi)→堿(jian)性蛋白酶(mei)酶(mei)解→離(li)心分(fen)離(li)→水洗(xi)沉淀→脫(tuo)色脫(tuo)脂→冷凍干燥(zao)→粉(fen)碎→成品

    　操作要(yao)點：自溶，在pH7.0環(huan)境(jing)中，按反(fan)應體積1%的(de)量(liang)加(jia)入風味蛋白酶，50℃下反(fan)應24h；破壁，在pH10.5環(huan)境(jing)中，按反(fan)應體積3%的(de)量(liang)加(jia)入NaCl，攪拌(ban)混勻，80℃下保(bao)持(chi)1h；酶解，在pH10.5環(huan)境(jing)中，按反(fan)應體積1%的(de)量(liang)加(jia)入Alcalase2 .4L ，攪拌(ban)混勻，80℃下反(fan)應3h。

    　1.3.1β—葡聚糖和甘露聚糖的單糖含量分析(xi)

　　方法制(zhi)備(bei)的β—葡聚(ju)(ju)(ju)糖(tang)(tang)成(cheng)品中可(ke)能還有(you)些(xie)其他物質，如甘(gan)露(lu)(lu)聚(ju)(ju)(ju)糖(tang)(tang)和蛋白質，其中甘(gan)露(lu)(lu)聚(ju)(ju)(ju)糖(tang)(tang)是由(you)甘(gan)露(lu)(lu)糖(tang)(tang)構成(cheng)的同一聚(ju)(ju)(ju)糖(tang)(tang)，本實驗(yan)同時測定(ding)(ding)甘(gan)露(lu)(lu)聚(ju)(ju)(ju)糖(tang)(tang)的含量，為β—葡聚(ju)(ju)(ju)糖(tang)(tang)含量的測定(ding)(ding)提供(gong)參(can)考(kao)。

    　準確稱取10mg 固體單糖標(biao)準品（先在105 ℃下烘干至(zhi)(zhi)恒重）、10mg 鹽酸羥胺于1.5mL小離心管中，加(jia)入0.5mL吡(bi)啶，放入90℃水(shui)浴中加(jia)熱反應30min，間歇(xie)振蕩。取出(chu)后冷卻至(zhi)(zhi)室溫，加(jia)入0.5mL乙酸酐(gan)，90℃下繼續水(shui)浴加(jia)熱反應30min，離心后取適量上清液(ye)直接進行氣相(xiang)色(se)譜分析。

    　1.3. 2 葡萄(tao)糖和甘(gan)露糖標準曲線的(de)繪制

 &內容從何(he)而來中華(hua)酒報nbsp;  　準(zhun)確稱取標(biao)(biao)準(zhun)葡(pu)萄糖(tang)(tang)和甘(gan)露(lu)糖(tang)(tang)各10mg，乙酰(xian)化后，葡(pu)萄糖(tang)(tang)和甘(gan)露(lu)糖(tang)(tang)衍生物濃度(du)同為10mg/mL，分(fen)別將(jiang)此(ci)濃度(du)葡(pu)萄糖(tang)(tang)和甘(gan)露(lu)糖(tang)(tang)衍生物按比例混(hun)合，配制成1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL和5mg/mL的混(hun)合糖(tang)(tang)液，同時做空(kong)白對照，立即進行(xing)氣相(xiang)色(se)譜分(fen)析，記錄色(se)譜峰(feng)面積(ji)，以其為縱坐標(biao)(biao)，并以混(hun)合糖(tang)(tang)液中每種糖(tang)(tang)的濃度(du)為橫坐標(biao)(biao)，繪制標(biao)(biao)準(zhun)曲(qu)線。

    　1.3.3 啤酒酵母多糖的水(shui)(shui)解(jie)和衍生(sheng)化準確稱取(qu)10mg多糖粉末于(yu)10mL離心試(shi)管中，加入(ru)2mL75%三(san)氟乙酸(suan)，封(feng)管，90℃下(xia)水(shui)(shui)浴3h，間歇振蕩，待酸(suan)水(shui)(shui)解(jie)完取(qu)出(chu)，將試(shi)管接入(ru)氮吹儀在(zai)80℃下(xia)蒸干，再加入(ru)1mL甲醇再次(ci)(ci)蒸干，重復(fu)3 次(ci)(ci)，以(yi)去除殘留三(san)氟乙酸(suan)。

    　1. 3.4 色譜(pu)條件

    　氣相色譜柱：DB—17 石英毛細管柱(30 m×0.32 mm，液膜厚0.25μm，Agilent) ；升(sheng)溫程序：初溫為(wei)160℃，以5℃/min 升(sheng)溫至180℃，再以2℃/min 升(sheng)溫至210℃，保留5min ；進樣口溫度：230℃，檢測器溫度：250℃；

    　載氣（氮(dan)氣）流(liu)(liu)(liu)速(su)：20mL/min，氫氣流(liu)(liu)(liu)速(su)：45mL/min，空氣流(liu)(liu)(liu)速(su)：400mL/min；分流(liu)(liu)(liu)比20：1，進樣(yang)量1μL。

    　乙(yi)酰化(hua)后，標準葡萄(tao)糖(tang)和甘露(lu)糖(tang)衍(yan)(yan)生(sheng)物(wu)的氣相色譜分析(xi)(xi)結(jie)果如圖1 所示，分析(xi)(xi)表(biao)明采用糖(tang)腈乙(yi)酸(suan)酯衍(yan)(yan)生(sheng)化(hua)的方法，一種(zhong)單糖(tang)只對應一種(zhong)衍(yan)(yan)生(sheng)化(hua)產物(wu)，在較低的200 ℃下(xia)即可分離出(chu)來。

    　兩種標準單糖(tang)衍生物保留時間分(fen)別(bie)為(wei)14.347min和15.016min，分(fen)析表明在1. 3.4 所(suo)采用的氣相色譜條件(jian)下(xia)，混(hun)合(he)單糖(tang)中(zhong)的兩種單糖(tang)出峰(feng)時間短，峰(feng)形對稱，隔得較開(kai)，并(bing)未出現拖尾現象。

　　2  實驗分析(xi)

    　2 .1 兩種標(biao)準(zhun)單糖衍生物的標(biao)準(zhun)曲線

  ;  　葡萄糖衍生(sheng)物標(biao)準(zhun)曲(qu)線（見圖1 ），甘露糖衍生(sheng)物標(biao)準(zhun)曲(qu)線（見圖2）。

　
    　根據標準(zhun)葡萄糖和甘露糖衍生物(wu)標準(zhun)曲(qu)線(xian)繪制(zhi)的操作(zuo)步驟。從曲(qu)線(xian)趨勢來看，兩種單糖衍生物(wu)出峰面(mian)積隨著糖濃度的增大而(er)呈線(xian)性(xing)增長。

    　2 .2 樣品(pin)水解單(dan)糖乙酰化產物的氣(qi)相色譜分(fen)析(xi)

    　ADEKA 株式會社是(shi)日本最大的(de)β—葡(pu)(pu)聚(ju)糖(tang)(tang)(tang)生產公司，這里將其(qi)(qi)進(jin)(jin)口產品與本實驗室制備的(de)成品中(zhong)葡(pu)(pu)聚(ju)糖(tang)(tang)(tang)和甘(gan)露聚(ju)糖(tang)(tang)(tang)含量進(jin)(jin)行比較，將兩(liang)種(zhong)樣(yang)品水(shui)(shui)解(jie)(jie)并乙酰化后(hou)，按(an)與混合標(biao)樣(yang)相同(tong)的(de)色(se)譜(pu)分析條件進(jin)(jin)行氣(qi)相色(se)譜(pu)分析，結(jie)果分別(bie)如圖4 和圖5 所(suo)示(shi)，其(qi)(qi)水(shui)(shui)解(jie)(jie)單(dan)糖(tang)(tang)(tang)保留時間與標(biao)準混合單(dan)糖(tang)(tang)(tang)的(de)保留時間對比分析表(biao)明，水(shui)(shui)解(jie)(jie)后(hou)的(de)兩(liang)種(zhong)單(dan)糖(tang)(tang)(tang)分別(bie)為(wei)葡(pu)(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)(tang)和甘(gan)露糖(tang)(tang)(tang)，其(qi)(qi)中(zhong)葡(pu)(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)(tang)含量較高。β—葡(pu)(pu)聚(ju)糖(tang)(tang)(tang)水(shui)(shui)解(jie)(jie)衍生化氣(qi)相色(se)譜(pu)圖（見圖3）。

    　2 .3 啤酒酵母(mu)中β—葡聚(ju)糖(tang)和甘(gan)露聚(ju)糖(tang)的含量計(ji)算

    　根(gen)據樣(yang)品中水解后每種單糖(tang)(tang)氣相分析的峰面積(ji)，代入葡(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)和(he)甘露(lu)(lu)糖(tang)(tang)的標準曲線(xian)，可算出(chu)葡(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)和(he)甘露(lu)(lu)糖(tang)(tang)的濃度，進一步計算出(chu)樣(yang)品中葡(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)和(he)甘露(lu)(lu)糖(tang)(tang)含量，從而最終得到(dao)β—葡(pu)聚糖(tang)(tang)和(he)甘露(lu)(lu)聚糖(tang)(tang)的含量，所有計算結果（見表1）。

    　從表1可以(yi)看出， 實驗室制備的(de)β—葡(pu)聚糖和甘(gan)露(lu)聚糖與日本進口β—葡(pu)聚糖的(de)含量都(dou)比(bi)較接近。樣品中組分測定的(de)重(zhong)現(xian)性(xing)實驗結果（見表2 ）。

    　根據2.3測(ce)定的(de)結果， 每10mg 樣(yang)品中β—葡(pu)聚糖和甘(gan)露聚糖含量分(fen)別為3.239mg和1.682mg，分(fen)別添加(jia)5mg葡(pu)萄糖和甘(gan)露糖進(jin)行測(ce)定，結果如表3所示(shi)，加(jia)標回收率為87.14%—101.2%，說明該(gai)方法準確性高， 能夠滿足檢測(ce)要求。樣(yang)品中組分(fen)的(de)回收率實驗結果（見表3 ）。

    　3  結論

    　本實驗建立的啤酒酵母β—葡聚糖含量的氣相色(se)譜測定(ding)法(fa)，前(qian)處理簡單、操作方便(bian)、重現(xian)性好、選擇性強(qiang)、精密度(du)高，符(fu)合實驗室對β—葡聚糖含量測定(ding)方法(fa)的要求。

　　在這個分(fen)析過程中，要注意： 

　　第一，糖(tang)(tang)類衍生化(hua)方(fang)法(fa)要(yao)(yao)求制備簡便、試劑易得(de)，而且每(mei)種(zhong)單糖(tang)(tang)要(yao)(yao)得(de)到單一的色譜(pu)峰，這對單糖(tang)(tang)的定量分(fen)析是十分(fen)重要(yao)(yao)的；第二，色譜(pu)柱(zhu)對于分(fen)離效果(guo)也很重要(yao)(yao)，在(zai)氣相(xiang)條件探索過程(cheng)中，比較(jiao)(jiao)了AC—5（非(fei)極性）和DB—17（中極性）兩種(zhong)毛細管色譜(pu)柱(zhu)，發現AC-5 出峰慢，分(fen)離不(bu)徹底，而DB—17 在(zai)較(jiao)(jiao)低溫(wen)度(du)下很快(kuai)就能出峰，而且不(bu)同單糖(tang)(tang)峰形對稱(cheng)，分(fen)隔較(jiao)(jiao)開，效果(guo)很好(hao)，于是選擇DB—17作為分(fen)析色譜(pu)柱(zhu)。