本文(wen)借鑒了一(yi)些植物多糖中單糖組分的分析方法,采用氣(qi)相色譜法直(zhi)接(jie)測定(ding)葡萄糖含(han)量(liang),具有分析速度快(kuai)、選擇性強、靈(ling)敏(min)度高和測定(ding)結果精確(que)可靠等優點,從而為啤酒酵母(mu)中β—葡聚糖含(han)量(liang)的測定(ding)提供(gong)新參考。
1 材料與(yu)方法
1.1 材料(liao)與(yu)試劑
啤酒酵(jiao)母廣州市珠江(jiang)啤酒廠(chang);β—葡聚糖日(ri)本ADEKA株(zhu)式會社;風味蛋白酶(mei)、Alcalase2.4L 諾維(wei)信公司;丙酮(tong)、三氟乙酸、鹽酸羥胺、吡啶、乙酸酐等天津市化(hua)學試劑一廠(chang),分(fen)析純(chun);標準葡萄糖、甘露糖 上海源聚生物科技有限(xian)公司,分(fen)析純(chun)。
1.2 .1儀器與(yu)設備
本(ben)實驗(yan)采用(yong)乙(yi)酰化(hua)(hua)作為衍(yan)(yan)生化(hua)(hua)方法,其反(fan)應(ying)(ying)原理是:標準(zhun)單(dan)糖和鹽酸羥(qian)胺在溶劑(ji)吡啶中加熱(re)反(fan)應(ying)(ying)生成糖肟,以乙(yi)酸酐作為乙(yi)酰化(hua)(hua)試(shi)劑(ji),在加熱(re)條件下繼續反(fan)應(ying)(ying),最(zui)后生成具有揮(hui)發(fa)性的糖腈乙(yi)酸酯衍(yan)(yan)生物。
GC—2014 氣相色譜(pu)儀(yi)(yi)配(pei)備(bei)氫火焰離(li)子(zi)化檢測器FID ,日(ri)本島津(jin)公(gong)(gong)司(si)(si)(si);KQ—250DE 型(xing)數控超聲(sheng)清洗器,昆山市(shi)超聲(sheng)儀(yi)(yi)儀(yi)(yi)器有(you)限(xian)公(gong)(gong)司(si)(si)(si);雷磁PHS—3C 精密(mi)pH 計,上海精科儀(yi)(yi)器有(you)限(xian)公(gong)(gong)司(si)(si)(si);N—EVAP111型(xing)氮吹儀(yi)(yi),美國Organomation公(gong)(gong)司(si)(si)(si);5804R型(xing)高速冷凍離(li)心機,德(de)國Eppendorf 公(gong)(gong)司(si)(si)(si);RE—52型(xing)旋轉蒸發儀(yi)(yi),上海亞榮生化儀(yi)(yi)器廠;SHZ—D(III) 型(xing)循環水式(shi)真(zhen)空(kong)泵,鞏(gong)義市(shi)予華儀(yi)(yi)器有(you)限(xian)責任公(gong)(gong)司(si)(si)(si);HHS型(xing)電(dian)熱恒溫(wen)水浴鍋(guo),上海博迅實業有(you)限(xian)公(gong)(gong)司(si)(si)(si)醫療設備(bei)廠。
1.2 .2β—葡聚糖的制備(bei)
工(gong)藝流(liu)程:新鮮啤(pi)酒(jiu)酵母→200目(mu)過(guo)篩除去啤(pi)酒(jiu)花等雜(za)質(zhi)→水洗(xi)除去剩余啤(pi)酒(jiu)→離(li)心分(fen)離(li)→將沉淀溶(rong)于水配成反(fan)應體系進行自(zi)溶(rong)→加(jia)鹽(yan)破壁(bi)→堿(jian)性蛋白酶(mei)酶(mei)解→離(li)心分(fen)離(li)→水洗(xi)沉淀→脫(tuo)色脫(tuo)脂→冷凍干燥(zao)→粉(fen)碎→成品
操作要(yao)點:自溶,在pH7.0環(huan)境(jing)中,按反(fan)應體積1%的(de)量(liang)加(jia)入風味蛋白酶,50℃下反(fan)應24h;破壁,在pH10.5環(huan)境(jing)中,按反(fan)應體積3%的(de)量(liang)加(jia)入NaCl,攪拌(ban)混勻,80℃下保(bao)持(chi)1h;酶解,在pH10.5環(huan)境(jing)中,按反(fan)應體積1%的(de)量(liang)加(jia)入Alcalase2 .4L ,攪拌(ban)混勻,80℃下反(fan)應3h。
1.3.1β—葡聚糖和甘露聚糖的單糖含量分析(xi)
方法制(zhi)備(bei)的β—葡聚(ju)(ju)(ju)糖(tang)(tang)成(cheng)品中可(ke)能還有(you)些(xie)其他物質,如甘(gan)露(lu)(lu)聚(ju)(ju)(ju)糖(tang)(tang)和蛋白質,其中甘(gan)露(lu)(lu)聚(ju)(ju)(ju)糖(tang)(tang)是由(you)甘(gan)露(lu)(lu)糖(tang)(tang)構成(cheng)的同一聚(ju)(ju)(ju)糖(tang)(tang),本實驗(yan)同時測定(ding)(ding)甘(gan)露(lu)(lu)聚(ju)(ju)(ju)糖(tang)(tang)的含量,為β—葡聚(ju)(ju)(ju)糖(tang)(tang)含量的測定(ding)(ding)提供(gong)參(can)考(kao)。
準確稱取10mg 固體單糖標(biao)準品(先在105 ℃下烘干至(zhi)(zhi)恒重)、10mg 鹽酸羥胺于1.5mL小離心管中,加(jia)入0.5mL吡(bi)啶,放入90℃水(shui)浴中加(jia)熱反應30min,間歇(xie)振蕩。取出(chu)后冷卻至(zhi)(zhi)室溫,加(jia)入0.5mL乙酸酐(gan),90℃下繼續水(shui)浴加(jia)熱反應30min,離心后取適量上清液(ye)直接進行氣相(xiang)色(se)譜分析。
1.3. 2 葡萄(tao)糖和甘(gan)露糖標準曲線的(de)繪制
&內容從何(he)而來中華(hua)酒報nbsp; 準(zhun)確稱取標(biao)(biao)準(zhun)葡(pu)萄糖(tang)(tang)和甘(gan)露(lu)糖(tang)(tang)各10mg,乙酰(xian)化后,葡(pu)萄糖(tang)(tang)和甘(gan)露(lu)糖(tang)(tang)衍生物濃度(du)同為10mg/mL,分(fen)別將(jiang)此(ci)濃度(du)葡(pu)萄糖(tang)(tang)和甘(gan)露(lu)糖(tang)(tang)衍生物按比例混(hun)合,配制成1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL和5mg/mL的混(hun)合糖(tang)(tang)液,同時做空(kong)白對照,立即進行(xing)氣相(xiang)色(se)譜分(fen)析,記錄色(se)譜峰(feng)面積(ji),以其為縱坐標(biao)(biao),并以混(hun)合糖(tang)(tang)液中每種糖(tang)(tang)的濃度(du)為橫坐標(biao)(biao),繪制標(biao)(biao)準(zhun)曲(qu)線。
1.3.3 啤酒酵母多糖的水(shui)(shui)解(jie)和衍生(sheng)化準確稱取(qu)10mg多糖粉末于(yu)10mL離心試(shi)管中,加入(ru)2mL75%三(san)氟乙酸(suan),封(feng)管,90℃下(xia)水(shui)(shui)浴3h,間歇振蕩,待酸(suan)水(shui)(shui)解(jie)完取(qu)出(chu),將試(shi)管接入(ru)氮吹儀在(zai)80℃下(xia)蒸干,再加入(ru)1mL甲醇再次(ci)(ci)蒸干,重復(fu)3 次(ci)(ci),以(yi)去除殘留三(san)氟乙酸(suan)。
1. 3.4 色譜(pu)條件
氣相色譜柱:DB—17 石英毛細管柱(30 m×0.32 mm,液膜厚0.25μm,Agilent) ;升(sheng)溫程序:初溫為(wei)160℃,以5℃/min 升(sheng)溫至180℃,再以2℃/min 升(sheng)溫至210℃,保留5min ;進樣口溫度:230℃,檢測器溫度:250℃;
載氣(氮(dan)氣)流(liu)(liu)(liu)速(su):20mL/min,氫氣流(liu)(liu)(liu)速(su):45mL/min,空氣流(liu)(liu)(liu)速(su):400mL/min;分流(liu)(liu)(liu)比20:1,進樣(yang)量1μL。
乙(yi)酰化(hua)后,標準葡萄(tao)糖(tang)和甘露(lu)糖(tang)衍(yan)(yan)生(sheng)物(wu)的氣相色譜分析(xi)(xi)結(jie)果如圖1 所示,分析(xi)(xi)表(biao)明采用糖(tang)腈乙(yi)酸(suan)酯衍(yan)(yan)生(sheng)化(hua)的方法,一種(zhong)單糖(tang)只對應一種(zhong)衍(yan)(yan)生(sheng)化(hua)產物(wu),在較低的200 ℃下(xia)即可分離出(chu)來。
兩種標準單糖(tang)衍生物保留時間分(fen)別(bie)為(wei)14.347min和15.016min,分(fen)析表明在1. 3.4 所(suo)采用的氣相色譜條件(jian)下(xia),混(hun)合(he)單糖(tang)中(zhong)的兩種單糖(tang)出峰(feng)時間短,峰(feng)形對稱,隔得較開(kai),并(bing)未出現拖尾現象。
2 實驗分析(xi)
2 .1 兩種標(biao)準(zhun)單糖衍生物的標(biao)準(zhun)曲線
葡萄糖衍生(sheng)物標(biao)準(zhun)曲(qu)線(見圖1 ),甘露糖衍生(sheng)物標(biao)準(zhun)曲(qu)線(見圖2)。
根據標準(zhun)葡萄糖和甘露糖衍生物(wu)標準(zhun)曲(qu)線(xian)繪制(zhi)的操作(zuo)步驟。從曲(qu)線(xian)趨勢來看,兩種單糖衍生物(wu)出峰面(mian)積隨著糖濃度的增大而(er)呈線(xian)性(xing)增長。
2 .2 樣品(pin)水解單(dan)糖乙酰化產物的氣(qi)相色譜分(fen)析(xi)
ADEKA 株式會社是(shi)日本最大的(de)β—葡(pu)(pu)聚(ju)糖(tang)(tang)(tang)生產公司,這里將其(qi)(qi)進(jin)(jin)口產品與本實驗室制備的(de)成品中(zhong)葡(pu)(pu)聚(ju)糖(tang)(tang)(tang)和甘(gan)露聚(ju)糖(tang)(tang)(tang)含量進(jin)(jin)行比較,將兩(liang)種(zhong)樣(yang)品水(shui)(shui)解(jie)(jie)并乙酰化后(hou),按(an)與混合標(biao)樣(yang)相同(tong)的(de)色(se)譜(pu)分析條件進(jin)(jin)行氣(qi)相色(se)譜(pu)分析,結(jie)果分別(bie)如圖4 和圖5 所(suo)示(shi),其(qi)(qi)水(shui)(shui)解(jie)(jie)單(dan)糖(tang)(tang)(tang)保留時間與標(biao)準混合單(dan)糖(tang)(tang)(tang)的(de)保留時間對比分析表(biao)明,水(shui)(shui)解(jie)(jie)后(hou)的(de)兩(liang)種(zhong)單(dan)糖(tang)(tang)(tang)分別(bie)為(wei)葡(pu)(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)(tang)和甘(gan)露糖(tang)(tang)(tang),其(qi)(qi)中(zhong)葡(pu)(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)(tang)含量較高。β—葡(pu)(pu)聚(ju)糖(tang)(tang)(tang)水(shui)(shui)解(jie)(jie)衍生化氣(qi)相色(se)譜(pu)圖(見圖3)。
2 .3 啤酒酵母(mu)中β—葡聚(ju)糖(tang)和甘(gan)露聚(ju)糖(tang)的含量計(ji)算
根(gen)據樣(yang)品中水解后每種單糖(tang)(tang)氣相分析的峰面積(ji),代入葡(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)和(he)甘露(lu)(lu)糖(tang)(tang)的標準曲線(xian),可算出(chu)葡(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)和(he)甘露(lu)(lu)糖(tang)(tang)的濃度,進一步計算出(chu)樣(yang)品中葡(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)和(he)甘露(lu)(lu)糖(tang)(tang)含量,從而最終得到(dao)β—葡(pu)聚糖(tang)(tang)和(he)甘露(lu)(lu)聚糖(tang)(tang)的含量,所有計算結果(見表1)。
從表1可以(yi)看出, 實驗室制備的(de)β—葡(pu)聚糖和甘(gan)露(lu)聚糖與日本進口β—葡(pu)聚糖的(de)含量都(dou)比(bi)較接近。樣品中組分測定的(de)重(zhong)現(xian)性(xing)實驗結果(見表2 )。
根據2.3測(ce)定的(de)結果, 每10mg 樣(yang)品中β—葡(pu)聚糖和甘(gan)露聚糖含量分(fen)別為3.239mg和1.682mg,分(fen)別添加(jia)5mg葡(pu)萄糖和甘(gan)露糖進(jin)行測(ce)定,結果如表3所示(shi),加(jia)標回收率為87.14%—101.2%,說明該(gai)方法準確性高, 能夠滿足檢測(ce)要求。樣(yang)品中組分(fen)的(de)回收率實驗結果(見表3 )。
3 結論
本實驗建立的啤酒酵母β—葡聚糖含量的氣相色(se)譜測定(ding)法(fa),前(qian)處理簡單、操作方便(bian)、重現(xian)性好、選擇性強(qiang)、精密度(du)高,符(fu)合實驗室對β—葡聚糖含量測定(ding)方法(fa)的要求。
在這個分(fen)析過程中,要注意:
第一,糖(tang)(tang)類衍生化(hua)方(fang)法(fa)要(yao)(yao)求制備簡便、試劑易得(de),而且每(mei)種(zhong)單糖(tang)(tang)要(yao)(yao)得(de)到單一的色譜(pu)峰,這對單糖(tang)(tang)的定量分(fen)析是十分(fen)重要(yao)(yao)的;第二,色譜(pu)柱(zhu)對于分(fen)離效果(guo)也很重要(yao)(yao),在(zai)氣相(xiang)條件探索過程(cheng)中,比較(jiao)(jiao)了AC—5(非(fei)極性)和DB—17(中極性)兩種(zhong)毛細管色譜(pu)柱(zhu),發現AC-5 出峰慢,分(fen)離不(bu)徹底,而DB—17 在(zai)較(jiao)(jiao)低溫(wen)度(du)下很快(kuai)就能出峰,而且不(bu)同單糖(tang)(tang)峰形對稱(cheng),分(fen)隔較(jiao)(jiao)開,效果(guo)很好(hao),于是選擇DB—17作為分(fen)析色譜(pu)柱(zhu)。