為了得到發酵(jiao)石(shi)榴(liu)(liu)汁的(de)優良(liang)菌(jun)種,并確定石(shi)榴(liu)(liu)酒(jiu)發酵(jiao)的(de)工(gong)藝參數,從(cong)自然發酵(jiao)的(de)石(shi)榴(liu)(liu)酒(jiu)醪中分離、純化石(shi)榴(liu)(liu)酒(jiu)酵(jiao)母(mu)菌(jun)種;通過單因(yin)素和正交試驗,確定石(shi)榴(liu)(liu)酒(jiu)發酵(jiao)的(de)工(gong)藝參數。
結(jie)果發現,分離純(chun)化(hua)的菌(jun)種(zhong)經(jing)形態(tai)特征和(he)26S rDNA D1/D2 區域(yu)序列分析鑒定(ding)為釀酒酵(jiao)母。由此(ci)確定(ding)的最佳工藝條件為:溫度28℃、pH 3.8、糖度為17%、二氧化(hua)硫的添加量為100 mg/L,最終(zhong)發酵(jiao)的石榴(liu)酒的酒度在(zai)10%VoL左右。
石(shi)榴(liu)酒是以(yi)石(shi)榴(liu)為(wei)原料,經剝皮、榨汁、發酵(jiao)、澄清、陳釀(niang)而成的果(guo)酒。其(qi)色澤(ze)光亮透明(ming),酒體(ti)純正,酸(suan)甜爽口,保留(liu)了石(shi)榴(liu)酸(suan)、甜、澀、鮮(xian)之天然風味(wei),含(han)有大量(liang)氨(an)基(ji)酸(suan)、多種維(wei)生(sheng)素等,具有很(hen)高的營養價值,并有生(sheng)津化(hua)(hua)食、健脾益胃、降壓降脂、軟化(hua)(hua)血管、保健美容(rong)及止瀉之功效。
經發酵(jiao)過的石榴(liu)汁抗(kang)氧化活性與丁基(ji)羧基(ji)茴(hui)香醚(BHA)相(xiang)近,明顯高(gao)于紅葡萄酒。中國(guo)石榴(liu)種植面積(ji)迅速擴大,尤其是河(he)南滎(ying)陽、衛輝等地形成了大的石榴(liu)園,產量已(yi)具規(gui)模,但是石榴(liu)不耐(nai)儲藏(zang),除鮮(xian)食外,每年都有許多果(guo)實因不能及(ji)時(shi)消費和加工而浪費,特(te)別是小(xiao)果(guo)和裂果(guo)。
近(jin)年來,從天然(ran)石(shi)榴汁中分離得到了(le)(le)一株高效(xiao)發酵石(shi)榴酒的(de)菌(jun)株,通過(guo)形(xing)態特征和26S rDNAD1/D2 區域序(xu)列(lie)(lie)分析鑒定為釀酒酵母(mu)系列(lie)(lie)。對其發酵工(gong)藝參數進行優化,獲得了(le)(le)酒體純正生物功(gong)效(xiao)高的(de)石(shi)榴酒生產最(zui)佳工(gong)藝,并探討了(le)(le)石(shi)榴的(de)綜(zong)合利用(yong),增加了(le)(le)石(shi)榴及其他相關農產品的(de)附加值。對提高石(shi)榴經濟效(xiao)益(yi),保護和發展(zhan)石(shi)榴產業(ye)有著非常重要的(de)意義(yi)。
1 材料與方法
1.1 材料
石(shi)榴:購自河南省新(xin)鄉(xiang)市衛輝(hui)。菌(jun)種:從(cong)石(shi)榴汁(zhi)自然發(fa)酵醪中分離(li)。分離(li)及(ji)保藏培養基(ji):馬鈴薯20%,蔗糖(tang)1%,石(shi)榴汁(zhi)40%,瓊脂2%。菌(jun)種鑒定材料:引物(wu)NL1(5’—GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG—3’)和(he)NL4(5’—GGT CCG TGT TTC AAG ACG G—3’),由上海生(sheng)工生(sheng)物(wu)工程技(ji)術服務有(you)限公司(si)合成。酵母基(ji)因組DNA提取試劑盒(Solarbio 公司(si)),PCR buffer、Tag 酶(mei)、dNTP(寶生(sheng)物(wu)工程(大連)有(you)限公司(si))。
1.2 主要儀器
PCR儀為T—Gradient (德國Biometra公司)。
1.3 方法
1.3.1 菌源的(de)制備(bei)取(qu)壓(ya)榨(zha)好的(de)石榴全(quan)汁置室(shi)溫(wen)進(jin)行自然發酵,使石榴汁內的(de)酵母(mu)大量繁殖,待有大量氣泡并有較(jiao)濃酒(jiu)味(wei)產生時(shi),即可供分離石榴酒(jiu)菌源。
1.3.2 菌種的(de)分離、純化取上(shang)述(shu)發酵(jiao)好的(de)石榴酒(jiu)醪進行梯度稀釋,均勻涂布至(zhi)分離用的(de)瓊(qiong)脂培養基上(shang),22℃—24℃恒溫培養36h,挑(tiao)單菌落培養直至(zhi)純化。
1.3.3 菌種(zhong)的(de)鑒定純化后的(de)菌株經菌落形態觀(guan)察(cha)和鏡(jing)檢,初(chu)步確定為(wei)酵(jiao)(jiao)母(mu)菌。同時,根據酵(jiao)(jiao)母(mu)菌分(fen)(fen)類學研究標準方(fang)法做分(fen)(fen)子鑒定。酵(jiao)(jiao)母(mu)核基因(yin)(yin)組(zu)的(de)提取(qu)使用酵(jiao)(jiao)母(mu)基因(yin)(yin)組(zu)DNA提取(qu)試劑盒,按照說明書操(cao)作。
使用(yong)(yong)引物(wu)NL1和NL4進行26S rDNA D1/D2區的擴增。PCR 反應(ying)液(ye)(ye)的組成(采(cai)用(yong)(yong)50μL體系):每管中含PCR緩(huan)沖液(ye)(ye)(10×)5.0μL;25mmol/LMgCl2 3.0μL;10mmol/LdNTP1.0μL;10μmol/LNL1 和NL4 各(ge)1ul;0.5 U/ul DNA 聚(ju)合酶0.3 μL;10ng/ul —1000ng/ul 模(mo)板DNA1.0μL;最后添(tian)加ddH2O 定容50μL。PCR循環次序為:95℃預(yu)變性(xing)5min,94℃變性(xing)1min,52℃退火1min,72℃延伸(shen)1min20s;循環36次;再72℃延伸(shen)8 min。PCR產物(wu)經1%瓊脂(zhi)糖凝膠電泳檢測(ce)(ce)后,由英俊生物(wu)技術有限公(gong)司測(ce)(ce)序。
1.3.4 發酵工藝的確定
發酵溫度的確定。
將石(shi)(shi)榴汁的(de)糖度(du)(du)調整為19%,pH調為4.0,添加SO2量(liang)為80mg/L。接(jie)種等量(liang)的(de)石(shi)(shi)榴酒酵母,分(fen)別置于24℃、26℃、28℃、30℃、32℃5個溫度(du)(du)梯度(du)(du)下培養。待不再有氣泡產(chan)生時停止(zhi)發(fa)酵,用來測定(ding)其(qi)殘(can)糖和酒精度(du)(du)。
發(fa)酵pH的確定(ding)。
將石(shi)榴汁的糖(tang)度通過添(tian)加蔗(zhe)糖(tang)調整為19%,添(tian)加SO2量(liang)(liang)為80mg/L,調pH分別(bie)為3.8、4.1、4.4、4.6、4.8,接(jie)種等量(liang)(liang)的石(shi)榴酒酵(jiao)母,置于28℃下(xia)發酵(jiao)。待不(bu)再產生氣泡時停止發酵(jiao),測(ce)定其殘糖(tang)和酒精(jing)度。
不(bu)同糖濃度(du)發酵的試驗(yan)。
利用(yong)蔗糖(tang),將石(shi)(shi)榴(liu)汁的糖(tang)度(du)分別調整為(wei)13%原創文(wen)章來源地華夏銀(yin)行酒報、15%、17%、19%、21%5個梯度(du),添加(jia)SO2量為(wei)80mg/L,調節pH為(wei)4.0,接種等量的石(shi)(shi)榴(liu)酒酵(jiao)母(mu)。置(zhi)于28℃下(xia)發酵(jiao)。待不再產生(sheng)氣泡(pao)時停止發酵(jiao),測定其殘糖(tang)和酒精度(du)。
SO2添加量的確定。
將石榴汁糖度調整為19%,pH調為4.0,分別選擇SO2的添加量為40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、120mg/L。接種等量石榴酒酵母,置于28℃下發酵。待不再產生氣泡時停止發酵,測定其殘糖和酒精度。正交試驗因素水平測試。以溫度、pH、糖度、SO2的添加量(liang)為(wei)因素,進行L9(34)正交(jiao)試驗(見表1),以確定各因素的最佳(jia)用量(liang)。
2 結果與分析
2.1 石(shi)榴酒酵母的分離鑒定
從自然發酵的石榴(liu)酒醪中分離出的酵母(mu)的菌(jun)(jun)落(luo)形態(tai)可以看出,所(suo)分離菌(jun)(jun)種的菌(jun)(jun)落(luo)形態(tai)特(te)征為:菌(jun)(jun)落(luo)乳白色,圓形較大(da),中間突起,濕潤(run)有光澤,邊(bian)緣成浸潤(run)狀。經(jing)鏡檢其細胞為橢(tuo)圓型,能進行出芽繁殖,符合果酒酵母(mu)的典型特(te)征。
經BLAST分(fen)析(xi)及序列相似性計算,所分(fen)離出的被(bei)測(ce)菌株的26S rRNAD1/D2 區基(ji)因序列與模(mo)式菌株(U44806)同源(yuan)性為(wei)99.4%,被(bei)鑒定為(wei)釀酒酵(jiao)母。
2.2 發(fa)酵條件單因素試(shi)驗結(jie)果
在適(shi)宜的溫(wen)度、pH、糖濃度下,酵母(mu)菌的生長繁殖和代謝速度都很迅速,較低的pH還可以保(bao)證添加(jia)的SO2以較多的游離態存在,更好地起到抑制有害微生物的作用(yong)。因此,試(shi)(shi)驗對(dui)上述參數(shu)進行了單因素試(shi)(shi)驗。
通過發酵過程觀察發現,發酵溫度(du)高(gao)(gao),發酵完(wan)成快,殘糖高(gao)(gao),酒精度(du)低,果酒風味不足(zu);發酵溫度(du)低,發酵完(wan)成較慢,殘糖低,酒精度(du)也高(gao)(gao)。
從(cong)不同(tong)溫度(du)下發酵樣品的殘糖和酒精度(du)結果來看,26℃是最(zui)適的發酵溫度(du)。
由不同pH下(xia)發(fa)酵(jiao)樣(yang)品的(de)(de)(de)(de)(de)殘(can)(can)糖和酒(jiu)(jiu)(jiu)精(jing)度(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)結果(guo)可以看出,不同pH對石榴酒(jiu)(jiu)(jiu)發(fa)酵(jiao)結束的(de)(de)(de)(de)(de)殘(can)(can)糖幾乎沒有影響,在(zai)pH4.6時(shi)(shi)(shi)殘(can)(can)糖較(jiao)低,但(dan)酒(jiu)(jiu)(jiu)精(jing)度(du)(du)也(ye)(ye)(ye)低。在(zai)pH3.8時(shi)(shi)(shi)產(chan)酒(jiu)(jiu)(jiu)精(jing)度(du)(du)最(zui)(zui)高,在(zai)pH超過4.4時(shi)(shi)(shi)雖然也(ye)(ye)(ye)能達到相(xiang)同的(de)(de)(de)(de)(de)酒(jiu)(jiu)(jiu)精(jing)度(du)(du),但(dan)發(fa)酵(jiao)后石榴酒(jiu)(jiu)(jiu)的(de)(de)(de)(de)(de)顏色(se)發(fa)黃,失去了(le)原本的(de)(de)(de)(de)(de)深紅色(se),影響石榴酒(jiu)(jiu)(jiu)的(de)(de)(de)(de)(de)外觀(guan)效果(guo)。因此,確定石榴酒(jiu)(jiu)(jiu)酵(jiao)母發(fa)酵(jiao)的(de)(de)(de)(de)(de)最(zui)(zui)適為(wei)pH3.8。由不同糖濃(nong)度(du)(du)下(xia)發(fa)酵(jiao)的(de)(de)(de)(de)(de)樣(yang)品的(de)(de)(de)(de)(de)殘(can)(can)糖和酒(jiu)(jiu)(jiu)精(jing)度(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)結果(guo)可以看出,隨(sui)著發(fa)酵(jiao)初糖的(de)(de)(de)(de)(de)提(ti)高,發(fa)酵(jiao)結束時(shi)(shi)(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)殘(can)(can)糖也(ye)(ye)(ye)隨(sui)之增(zeng)加,而最(zui)(zui)終酒(jiu)(jiu)(jiu)精(jing)度(du)(du)也(ye)(ye)(ye)逐漸隨(sui)之增(zeng)加,在(zai)糖度(du)(du)為(wei)19%時(shi)(shi)(shi)達到最(zui)(zui)大(da),而后又(you)開始下(xia)降(jiang)。
因此,并不是(shi)糖(tang)(tang)度越高(gao),酒精的轉化率(lv)就越高(gao),過高(gao)的糖(tang)(tang)度可(ke)能(neng)會(hui)抑制酵母菌對糖(tang)(tang)的利用。這(zhe)可(ke)能(neng)是(shi)糖(tang)(tang)度過高(gao)時,酵母菌所處環境(jing)的滲透(tou)壓超出了其(qi)所耐受(shou)的能(neng)力,從而抑制了其(qi)生理活動。
從試驗結果來看,石榴酒酵母發酵的最適糖度為19%。在果酒釀造過程中都會添加一定量的SO2,起到抑制雜菌、護色、澄清、增酸和改善口味等作用。但添加過多會影響酒的風味、抑制酵母菌的發酵及出現酒液中殘留硫量超標等危害。由SO2對石榴酒發酵結束的殘糖和酒精度的影響可看出,SO2對石榴酒發酵結束時的(de)殘糖濃度幾(ji)乎沒有影響,對最終酒精度的(de)影響也(ye)較小(xiao),均為(wei)(wei)6%左右,而添(tian)加量為(wei)(wei)80mg/L 時酒精度稍高一點,為(wei)(wei)6.1%。
2.3 正交試驗(yan)結(jie)果
發(fa)酵溫(wen)度、pH、糖(tang)度(%)和SO2的添加量(mg/L)4因素(su)正交試驗結果見表2。
由表2 可以看出,對酒精度影響程度的主次順序為糖度(C)> 溫度(A)>pH(B)>SO2的添加量(D),即糖度、溫度和pH 對石榴果酒的酒精度影響較大,而SO2的添加量對石榴酒酵母發酵的影響較小,其最優方案為A2B1C1D3,即溫度為28℃,pH為3.8,糖度為17%,SO2的(de)添加量為100mg/L時(shi),石榴酒酵母(mu)發(fa)酵石榴汁產(chan)酒度(du)最好。
3 結論
研(yan)究(jiu)從(cong)自然發酵(jiao)的石榴酒醪里(li)分離(li)出了一株能高(gao)效發酵(jiao)石榴汁的酵(jiao)母菌種,通過基因組分析(xi)初步鑒定為釀(niang)酒酵(jiao)母。
通過(guo)正交優(you)化(hua)試驗,獲得了最(zui)佳石(shi)榴酒釀造(zao)條件,并確定了釀造(zao)過(guo)程中影響酒精度因素(su)為糖度>溫度>pH>二氧化(hua)硫添加量。
石榴酒(jiu)艷若朝霞,果(guo)香純正,優雅,更(geng)因其獨特的食療保健作(zuo)用,極具發(fa)展潛力(li),發(fa)展果(guo)酒(jiu)符(fu)合國家產(chan)(chan)業政策的要(yao)求(qiu)。而做好(hao)研(yan)究為(wei)石榴酒(jiu)規模生產(chan)(chan)提供了重要(yao)參考。大力(li)發(fa)展石榴果(guo)樹栽培,選育優良品(pin)種,對開(kai)發(fa)石榴酒(jiu)等系列產(chan)(chan)品(pin)很(hen)重要(yao)。