為了得到發酵(jiao)石(shi)榴(liu)(liu)汁的(de)優良(liang)菌(jun)種，并確定石(shi)榴(liu)(liu)酒(jiu)發酵(jiao)的(de)工(gong)藝參數，從(cong)自然發酵(jiao)的(de)石(shi)榴(liu)(liu)酒(jiu)醪中分離、純化石(shi)榴(liu)(liu)酒(jiu)酵(jiao)母(mu)菌(jun)種；通過單因(yin)素和正交試驗，確定石(shi)榴(liu)(liu)酒(jiu)發酵(jiao)的(de)工(gong)藝參數。

　　結(jie)果發現，分離純(chun)化(hua)的菌(jun)種(zhong)經(jing)形態(tai)特征和(he)26S rDNA D1/D2 區域(yu)序列分析鑒定(ding)為釀酒酵(jiao)母。由此(ci)確定(ding)的最佳工藝條件為：溫度28℃、pH 3.8、糖度為17%、二氧化(hua)硫的添加量為100 mg/L，最終(zhong)發酵(jiao)的石榴(liu)酒的酒度在(zai)10%VoL左右。

    　石(shi)榴(liu)酒是以(yi)石(shi)榴(liu)為(wei)原料，經剝皮、榨汁、發酵(jiao)、澄清、陳釀(niang)而成的果(guo)酒。其(qi)色澤(ze)光亮透明(ming)，酒體(ti)純正，酸(suan)甜爽口，保留(liu)了石(shi)榴(liu)酸(suan)、甜、澀、鮮(xian)之天然風味(wei)，含(han)有大量(liang)氨(an)基(ji)酸(suan)、多種維(wei)生(sheng)素等，具有很(hen)高的營養價值，并有生(sheng)津化(hua)(hua)食、健脾益胃、降壓降脂、軟化(hua)(hua)血管、保健美容(rong)及止瀉之功效。

　　經發酵(jiao)過的石榴(liu)汁抗(kang)氧化活性與丁基(ji)羧基(ji)茴(hui)香醚（BHA）相(xiang)近，明顯高(gao)于紅葡萄酒。中國(guo)石榴(liu)種植面積(ji)迅速擴大，尤其是河(he)南滎(ying)陽、衛輝等地形成了大的石榴(liu)園，產量已(yi)具規(gui)模，但是石榴(liu)不耐(nai)儲藏(zang)，除鮮(xian)食外，每年都有許多果(guo)實因不能及(ji)時(shi)消費和加工而浪費，特(te)別是小(xiao)果(guo)和裂果(guo)。

    　近(jin)年來，從天然(ran)石(shi)榴汁中分離得到了(le)(le)一株高效(xiao)發酵石(shi)榴酒的(de)菌(jun)株，通過(guo)形(xing)態特征和26S rDNAD1/D2 區域序(xu)列(lie)(lie)分析鑒定為釀酒酵母(mu)系列(lie)(lie)。對其發酵工(gong)藝參數進行優化，獲得了(le)(le)酒體純正生物功(gong)效(xiao)高的(de)石(shi)榴酒生產最(zui)佳工(gong)藝，并探討了(le)(le)石(shi)榴的(de)綜(zong)合利用(yong)，增加了(le)(le)石(shi)榴及其他相關農產品的(de)附加值。對提高石(shi)榴經濟效(xiao)益(yi)，保護和發展(zhan)石(shi)榴產業(ye)有著非常重要的(de)意義(yi)。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

    　石(shi)榴：購自河南省新(xin)鄉(xiang)市衛輝(hui)。菌(jun)種：從(cong)石(shi)榴汁(zhi)自然發(fa)酵醪中分離(li)。分離(li)及(ji)保藏培養基(ji)：馬鈴薯20%，蔗糖(tang)1%，石(shi)榴汁(zhi)40%，瓊脂2%。菌(jun)種鑒定材料：引物(wu)NL1（5’—GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG—3’）和(he)NL4（5’—GGT CCG TGT TTC AAG ACG G—3’），由上海生(sheng)工生(sheng)物(wu)工程技(ji)術服務有(you)限公司(si)合成。酵母基(ji)因組DNA提取試劑盒（Solarbio 公司(si)），PCR buffer、Tag 酶(mei)、dNTP（寶生(sheng)物(wu)工程（大連）有(you)限公司(si)）。

    　1.2 主要儀器

    　PCR儀為T—Gradient （德國Biometra公司）。

    　1.3 方法

    　1.3.1 菌源的(de)制備(bei)取(qu)壓(ya)榨(zha)好的(de)石榴全(quan)汁置室(shi)溫(wen)進(jin)行自然發酵，使石榴汁內的(de)酵母(mu)大量繁殖，待有大量氣泡并有較(jiao)濃酒(jiu)味(wei)產生時(shi)，即可供分離石榴酒(jiu)菌源。

    　1.3.2 菌種的(de)分離、純化取上(shang)述(shu)發酵(jiao)好的(de)石榴酒(jiu)醪進行梯度稀釋，均勻涂布至(zhi)分離用的(de)瓊(qiong)脂培養基上(shang)，22℃—24℃恒溫培養36h，挑(tiao)單菌落培養直至(zhi)純化。

    　1.3.3 菌種(zhong)的(de)鑒定純化后的(de)菌株經菌落形態觀(guan)察(cha)和鏡(jing)檢，初(chu)步確定為(wei)酵(jiao)(jiao)母(mu)菌。同時，根據酵(jiao)(jiao)母(mu)菌分(fen)(fen)類學研究標準方(fang)法做分(fen)(fen)子鑒定。酵(jiao)(jiao)母(mu)核基因(yin)(yin)組(zu)的(de)提取(qu)使用酵(jiao)(jiao)母(mu)基因(yin)(yin)組(zu)DNA提取(qu)試劑盒，按照說明書操(cao)作。

　　使用(yong)(yong)引物(wu)NL1和NL4進行26S rDNA D1/D2區的擴增。PCR 反應(ying)液(ye)(ye)的組成（采(cai)用(yong)(yong)50μL體系）：每管中含PCR緩(huan)沖液(ye)(ye)（10×）5.0μL；25mmol/LMgCl2 3.0μL；10mmol/LdNTP1.0μL；10μmol/LNL1 和NL4 各(ge)1ul；0.5 U/ul DNA 聚(ju)合酶0.3 μL；10ng/ul —1000ng/ul 模(mo)板DNA1.0μL；最后添(tian)加ddH2O 定容50μL。PCR循環次序為：95℃預(yu)變性(xing)5min，94℃變性(xing)1min，52℃退火1min，72℃延伸(shen)1min20s；循環36次；再72℃延伸(shen)8 min。PCR產物(wu)經1%瓊脂(zhi)糖凝膠電泳檢測(ce)(ce)后，由英俊生物(wu)技術有限公(gong)司測(ce)(ce)序。

    　1.3.4 發酵工藝的確定

       發酵溫度的確定。
　　將石(shi)(shi)榴汁的(de)糖度(du)(du)調整為19%，pH調為4.0，添加SO2量(liang)為80mg/L。接(jie)種等量(liang)的(de)石(shi)(shi)榴酒酵母，分(fen)別置于24℃、26℃、28℃、30℃、32℃5個溫度(du)(du)梯度(du)(du)下培養。待不再有氣泡產(chan)生時停止(zhi)發(fa)酵，用來測定(ding)其(qi)殘(can)糖和酒精度(du)(du)。

    　發(fa)酵pH的確定(ding)。

　　將石(shi)榴汁的糖(tang)度通過添(tian)加蔗(zhe)糖(tang)調整為19%，添(tian)加SO2量(liang)(liang)為80mg/L，調pH分別(bie)為3.8、4.1、4.4、4.6、4.8，接(jie)種等量(liang)(liang)的石(shi)榴酒酵(jiao)母，置于28℃下(xia)發酵(jiao)。待不(bu)再產生氣泡時停止發酵(jiao)，測(ce)定其殘糖(tang)和酒精(jing)度。

    　不(bu)同糖濃度(du)發酵的試驗(yan)。

　　利用(yong)蔗糖(tang)，將石(shi)(shi)榴(liu)汁的糖(tang)度(du)分別調整為(wei)13%原創文(wen)章來源地華夏銀(yin)行酒報、15%、17%、19%、21%5個梯度(du)，添加(jia)SO2量為(wei)80mg/L，調節pH為(wei)4.0，接種等量的石(shi)(shi)榴(liu)酒酵(jiao)母(mu)。置(zhi)于28℃下(xia)發酵(jiao)。待不再產生(sheng)氣泡(pao)時停止發酵(jiao)，測定其殘糖(tang)和酒精度(du)。

　　SO₂添加量的確定。

　　將石榴汁糖度調整為19%，pH調為4.0，分別選擇SO2的添加量為40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、120mg/L。接種等量石榴酒酵母，置于28℃下發酵。待不再產生氣泡時停止發酵，測定其殘糖和酒精度。正交試驗因素水平測試。以溫度、pH、糖度、SO₂的添加量(liang)為(wei)因素，進行L9（34）正交(jiao)試驗（見表1），以確定各因素的最佳(jia)用量(liang)。

　　2 結果與分析

　　2.1 石(shi)榴酒酵母的分離鑒定

　　從自然發酵的石榴(liu)酒醪中分離出的酵母(mu)的菌(jun)(jun)落(luo)形態(tai)可以看出，所(suo)分離菌(jun)(jun)種的菌(jun)(jun)落(luo)形態(tai)特(te)征為：菌(jun)(jun)落(luo)乳白色，圓形較大(da)，中間突起，濕潤(run)有光澤，邊(bian)緣成浸潤(run)狀。經(jing)鏡檢其細胞為橢(tuo)圓型，能進行出芽繁殖，符合果酒酵母(mu)的典型特(te)征。

　　經BLAST分(fen)析(xi)及序列相似性計算，所分(fen)離出的被(bei)測(ce)菌株的26S rRNAD1/D2 區基(ji)因序列與模(mo)式菌株（U44806）同源(yuan)性為(wei)99.4%，被(bei)鑒定為(wei)釀酒酵(jiao)母。

　　2.2 發(fa)酵條件單因素試(shi)驗結(jie)果

　　在適(shi)宜的溫(wen)度、pH、糖濃度下，酵母(mu)菌的生長繁殖和代謝速度都很迅速，較低的pH還可以保(bao)證添加(jia)的SO2以較多的游離態存在，更好地起到抑制有害微生物的作用(yong)。因此，試(shi)(shi)驗對(dui)上述參數(shu)進行了單因素試(shi)(shi)驗。

    　通過發酵過程觀察發現，發酵溫度(du)高(gao)(gao)，發酵完(wan)成快，殘糖高(gao)(gao)，酒精度(du)低，果酒風味不足(zu)；發酵溫度(du)低，發酵完(wan)成較慢，殘糖低，酒精度(du)也高(gao)(gao)。

　　從(cong)不同(tong)溫度(du)下發酵樣品的殘糖和酒精度(du)結果來看，26℃是最(zui)適的發酵溫度(du)。

　　由不同pH下(xia)發(fa)酵(jiao)樣(yang)品的(de)(de)(de)(de)(de)殘(can)(can)糖和酒(jiu)(jiu)(jiu)精(jing)度(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)結果(guo)可以看出，不同pH對石榴酒(jiu)(jiu)(jiu)發(fa)酵(jiao)結束的(de)(de)(de)(de)(de)殘(can)(can)糖幾乎沒有影響，在(zai)pH4.6時(shi)(shi)(shi)殘(can)(can)糖較(jiao)低，但(dan)酒(jiu)(jiu)(jiu)精(jing)度(du)(du)也(ye)(ye)(ye)低。在(zai)pH3.8時(shi)(shi)(shi)產(chan)酒(jiu)(jiu)(jiu)精(jing)度(du)(du)最(zui)(zui)高，在(zai)pH超過4.4時(shi)(shi)(shi)雖然也(ye)(ye)(ye)能達到相(xiang)同的(de)(de)(de)(de)(de)酒(jiu)(jiu)(jiu)精(jing)度(du)(du)，但(dan)發(fa)酵(jiao)后石榴酒(jiu)(jiu)(jiu)的(de)(de)(de)(de)(de)顏色(se)發(fa)黃，失去了(le)原本的(de)(de)(de)(de)(de)深紅色(se)，影響石榴酒(jiu)(jiu)(jiu)的(de)(de)(de)(de)(de)外觀(guan)效果(guo)。因此，確定石榴酒(jiu)(jiu)(jiu)酵(jiao)母發(fa)酵(jiao)的(de)(de)(de)(de)(de)最(zui)(zui)適為(wei)pH3.8。由不同糖濃(nong)度(du)(du)下(xia)發(fa)酵(jiao)的(de)(de)(de)(de)(de)樣(yang)品的(de)(de)(de)(de)(de)殘(can)(can)糖和酒(jiu)(jiu)(jiu)精(jing)度(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)結果(guo)可以看出，隨(sui)著發(fa)酵(jiao)初糖的(de)(de)(de)(de)(de)提(ti)高，發(fa)酵(jiao)結束時(shi)(shi)(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)殘(can)(can)糖也(ye)(ye)(ye)隨(sui)之增(zeng)加，而最(zui)(zui)終酒(jiu)(jiu)(jiu)精(jing)度(du)(du)也(ye)(ye)(ye)逐漸隨(sui)之增(zeng)加，在(zai)糖度(du)(du)為(wei)19%時(shi)(shi)(shi)達到最(zui)(zui)大(da)，而后又(you)開始下(xia)降(jiang)。

    　因此，并不是(shi)糖(tang)(tang)度越高(gao)，酒精的轉化率(lv)就越高(gao)，過高(gao)的糖(tang)(tang)度可(ke)能(neng)會(hui)抑制酵母菌對糖(tang)(tang)的利用。這(zhe)可(ke)能(neng)是(shi)糖(tang)(tang)度過高(gao)時，酵母菌所處環境(jing)的滲透(tou)壓超出了其(qi)所耐受(shou)的能(neng)力，從而抑制了其(qi)生理活動。

　　從試驗結果來看，石榴酒酵母發酵的最適糖度為19%。在果酒釀造過程中都會添加一定量的SO₂，起到抑制雜菌、護色、澄清、增酸和改善口味等作用。但添加過多會影響酒的風味、抑制酵母菌的發酵及出現酒液中殘留硫量超標等危害。由SO₂對石榴酒發酵結束的殘糖和酒精度的影響可看出，SO₂對石榴酒發酵結束時的(de)殘糖濃度幾(ji)乎沒有影響，對最終酒精度的(de)影響也(ye)較小(xiao)，均為(wei)(wei)6%左右，而添(tian)加量為(wei)(wei)80mg/L 時酒精度稍高一點，為(wei)(wei)6.1%。

    　2.3 正交試驗(yan)結(jie)果

    　發(fa)酵溫(wen)度、pH、糖(tang)度（%）和SO2的添加量（mg/L）4因素(su)正交試驗結果見表2。

　　由表2 可以看出，對酒精度影響程度的主次順序為糖度（C）＞ 溫度（A）＞pH（B）＞SO2的添加量（D），即糖度、溫度和pH 對石榴果酒的酒精度影響較大，而SO2的添加量對石榴酒酵母發酵的影響較小，其最優方案為A₂B₁C₁D₃，即溫度為28℃，pH為3.8，糖度為17%，SO₂的(de)添加量為100mg/L時(shi)，石榴酒酵母(mu)發(fa)酵石榴汁產(chan)酒度(du)最好。

    　3 結論

    　研(yan)究(jiu)從(cong)自然發酵(jiao)的石榴酒醪里(li)分離(li)出了一株能高(gao)效發酵(jiao)石榴汁的酵(jiao)母菌種，通過基因組分析(xi)初步鑒定為釀(niang)酒酵(jiao)母。

　　通過(guo)正交優(you)化(hua)試驗，獲得了最(zui)佳石(shi)榴酒釀造(zao)條件，并確定了釀造(zao)過(guo)程中影響酒精度因素(su)為糖度＞溫度＞pH＞二氧化(hua)硫添加量。

　　石榴酒(jiu)艷若朝霞，果(guo)香純正，優雅，更(geng)因其獨特的食療保健作(zuo)用，極具發(fa)展潛力(li)，發(fa)展果(guo)酒(jiu)符(fu)合國家產(chan)(chan)業政策的要(yao)求(qiu)。而做好(hao)研(yan)究為(wei)石榴酒(jiu)規模生產(chan)(chan)提供了重要(yao)參考。大力(li)發(fa)展石榴果(guo)樹栽培，選育優良品(pin)種，對開(kai)發(fa)石榴酒(jiu)等系列產(chan)(chan)品(pin)很(hen)重要(yao)。